Найбагатшої за кількістю і різноманітністю шляхів метаболізму групою організмів є прокаріоти. Частина з них, щоб синтезувати АТФ (основну енергетичну “валюту” клітини), використовують схему аеробного дихання, типову для більшості еукаріотів. Мікроорганізми, що не володіють даними механізмом, називаються анаеробами. Ці бактерії здатні отримувати енергію з хімічних сполук без участі кисню.
Класифікація анаеробів
По відношенню до кисню виділяють дві групи анаеробних бактерій:
- факультативні – можуть отримувати енергію як з участю кисню, так і без нього, перехід з одного типу метаболізму на інший залежить від умов середовища;
- облігатні – ніколи не використовують O2.
Для факультативних анаеробів безкисневий тип метаболізму має приспособительное значення, і бактерії удаються до неї тільки в крайньому випадку, при попаданні в анаеробну середу. Це пояснюється тим, що кисневе дихання енергетично набагато вигідніший.
У іншої групи анаеробів відсутня біохімічний механізм використання O2 для окислення сполук, і присутність цього елемента у навколишньому середовищі не тільки не корисно, але і токсичне.
Виділяють кілька типів облігатних анаеробів, що розрізняються по стійкості до присутності молекулярного кисню:
- суворі гинуть навіть при незначній концентрації O2;
- помірно суворі характеризуються середньою або високою стійкістю до присутності кисню;
- аэротолерантные – особлива група прокаріотів, здатна не тільки виживати, але і рости в повітряному середовищі.
Ставлення конкретної бактерії до кисню можна визначити за характером її зростання в товщі живильного середовища.
До аэротолерантным мікроорганізмів відносять молочнокислі бактерії. Деякі види (наприклад, Clostridium) можуть бути стійкі до високої концентрації кисню за рахунок утворення эндоспор.
Анаеробний енергетичний метаболізм
Всі анаероби – це типові хемотрофы, оскільки в якості джерела енергії використовують енергію хімічних зв’язків. При цьому енергетичними донорами можуть бути як органічні речовини (хемоорганотрофия), так і неорганічні (хемолитотрофия).
У бактерій-анаеробів існують два різновиди бескислородного метаболізму: дихання і бродіння. Принципова відмінність між ними полягає в механізмі асиміляції енергії.
Так, при бродінні енергія спочатку запасається в фосфагенной формі (наприклад, у вигляді фосфоенолпирувата), а потім за участю цитозольных дегідрогеназ відбувається субстратне фосфолирирование АДФ. Електрони при цьому передаються ендогенного або екзогенному акцептору, який стає побічним продуктом процесу.
При дихальному тип метаболізму енергія запасається у специфічному сполученні – Pmf, який або відразу використовується для клітинних процесів, або поступає в зосереджену на мембрані электротранспортную ланцюг, де синтезується АТФ. Тільки, на відміну від аеробного дихання, кінцевим акцептором електронів служить не кисень, а інше з’єднання, яке може мати як органічну, так і неорганічну природу.
Різновиди анаеробного дихання
Основне завдання, яку вирішує анаеробна бактерія з дихальним типом метаболізму, – знайти альтернативу молекулярного кисню. Саме від цього залежить энергитический вихід реакції. Залежно від речовини, що виконує роль термінального акцептора, розрізняють наступні види анаеробного дихання:
- нітратне;
- залізне;
- фумаратное;
- сульфатное;
- сірчане;
- карбонатное.
Анаеробне дихання менш ефективно, ніж аеробне, але порівняно з бродінням дає набагато більший енергетичний вихлоп.
Анаеробне деструктивне співтовариство бактерій
Даний тип мікробіоти утворюється в багатих органікою екологічних нішах, в яких кисень практично повністю витрачений (затоплювані ґрунти, підземні гідросистеми, мулисті відклади тощо). Тут відбувається ступінчата деградація органічних сполук, що здійснюється двома групами бактерій:
- первинні анаероби відповідають за перший етап дессимиляции органіки;
- вторинні анаероби – це мікроорганізми з метаболізмом дихального типу.
Серед первинних анаеробів розрізняють гидролитиков і диссипотрофов, які пов’язані один з одним трофічними взаємодіями. Гидролитики утворюють біоплівки на поверхні твердих субстратів і продукують гідролітичні экзоферменты, які розщеплюють складні органічні сполуки на олігомери і мономери.
Утворилися поживний субстрат в першу чергу використовуються самими гидролитиками, але також і диссипотрофами. Останні зазвичай менш кооперовані і не виділяють значних кількостей экзоферментов, поглинаючи готові продукти гідролізу біополімерів. Характерним представником диссипотрофов є бактерії роду Syntrophomonas.
Культивування
Особливі вимоги щодо вирощування пред’являються тільки до облігатно-анаеробних бактерій. Факультативні чудово розмножуються в кисневій середовищі.
Методи культивування анаеробних мікроорганізмів поділяються на три категорії: хімічні, фізичні і біологічні. Їх основне завдання полягає в тому, щоб знизити або повністю виключити присутність кисню в живильному середовищі. Ступінь допустимої концентрації O2 визначається рівнем толерантності конкретного анаероба.
Фізичні методи
Суть фізичних методів полягає в тому, щоб прибрати кисень з повітряного середовища, з якою контактує культура, або повністю виключити контакт бактерій з повітрям. До даної групи відносять такі технології культивування:
- вирощування в микроаэростате – спеціальному приладі, в якому замість атмосферного повітря створюється штучна газова суміш;
- глибинне культивування – посів бактерій не на поверхню, а високим шаром або в товщу середовища таким чином, щоб туди не проникав повітря;
- використання в’язких середовищ, в яких дифузія O2 знижується із збільшенням щільності;
- вирощування в анаеробній банку;
- заливка поверхні середовища вазеліновим маслом або парафіном;
- використання CO2-інкубатора;
- застосування анаеробної станції SIMPLICITY 888 (найсучасніший метод).
Обов’язковою частиною фізичних методів є попереднє кип’ятіння живильного середовища, щоб видалити з неї молекулярний кисень.
Використання хімічних речовин
Хімічні сполуки, що використовуються для вирощування анаеробів, поділяють на 2 групи:
- Поглиначі кисню сорбують молекули O2. Поглинаюча здатність залежить від виду речовини і об’єму повітряного простору в середовищі. Найбільш часто застосовують пирогаллол (лужний розчин), металеве залізо, хлорид одновалентной міді, дитионит натрію.
- Відновлюючі агенти (цистеїн, дитиотрейтол, аскорбінова кислота та ін) знижують окислювально-відновний потенціал середовища.
Особливою різновидом хімічних методів є використання газогенеруючий систем, до складу яких входять агенти, генеруючі водень і вуглекислий газ, а O2 поглинає паладієвий каталізатор. Такі системи застосовують в замкнутих ємкостях для вирощування (анаэростаты, пластикові пакети тощо).
Біологічні методи
До біологічних методів відносять спільне вирощування анаеробів і аеробів. Останні видаляють з середовища кисень, створюючи умови для зростання своїх “співмешканців”. Як сорбуючими агентів можуть використовувати і факультативно-анаеробні бактерії.
Існує дві модифікації даного методу:
- Посів двох культур на різні половини чашки Петрі, яку потім закривають кришкою.
- Посів з використанням “годинникового скла”, що містить середу з аеробної бактерією. Таким склом накривають чашку Петрі суцільним шаром засіяну анаеробної культурою.
Іноді аеробні мікроорганізми використовують на етапі підготовки рідкого живильного середовища для інокуляції анаеробів. Після видалення залишкового кисню аэроба (наприклад, E. colli) вбивають нагріванням, а потім засівають потрібну культуру.
Виділення чистої культури
Чистою культурою називають популяцію мікроорганізмів, що належить до одного виду, що володіє одними властивостями і отриману з однієї клітини. Для отримання групи бактерій з такими характеристиками зазвичай використовують методи истончающего штриха і граничних розведень, але робота з анаеробами – це особливий процес, що вимагає виключення контакту з киснем при отримання ізольованих колоній.
Існує кілька способів виділення чистої культури анаеробів. До них відносяться:
- Метод Цейсслера – посів истончающим штрихом на чашки Петрі з створенням анаеробних умов і наступною інкубацією у термостаті (від 24 до 72 годин).
- Метод Вейнберга – виділення анаеробів в культуру з використанням цукрового агару (посів високим стовпчиком), бактерії переносяться запаяним капіляр. Спочатку матеріал поміщається в пробірку з ізотонічним розчином (етап розведення), потім у пробірку з агаром, що мають температуру 40-45 градусів, в якій ретельно перемішується із середовищем. Після цього відбувається послідовний пересівши в ще 2 пробірки, остання з яких охолоджується під струменем води.
- Метод Перетца – розведений в ізотонічному розчині матеріал заливають в чашку Петрі таким чином, щоб вона заповнила простір під лежить на її дні скляною пластинкою, на якій і повинен початися зростання.
У всіх трьох методах матеріал з отриманих ізольованих колоній пересевается на середовище контролю стерильності (СКС) або середовище володіє нескінченним набором знань-Тароцци.
